здобувач Саліонов В.О., д. фарм. н., проф. Панасенко О.І., д. фарм. н., проф. Книш Є.Г., д. вет. н., проф. Ткаченко О.А., к. вет. н., доц. Зажарський В.В., к. вет. н., ст. викл. Давиденко П.О., к. вет. н., доц. Білан М.В.

Запорізький державний медичний університет, Україна

Вплив концентрації ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату та рН середовища 7,1 на культивування патогенних М. bovis за температури 37 °С

Протягом останніх десятиліть у всьому світі, а особливо в Україні, різко погіршується епідемічна ситуація з туберкульозу. Незважаючи на накопичений досвід у боротьбі та профілактиці цього захворювання, туберкульоз і на сьогоднішній день є однією з важливих проблем. Все більш актуальнішим стає питання своєчасного виявлення хвороби та ефективної боротьби з її збудником.

Питання біологічних властивостей мікобактерій, зокрема бичачого виду, дотепер потребують вивчення, оскільки з’являються все нові й нові повідомлення авторів про особливості деяких з них. Так, в 2004 році повідомлено про M. bovis швидкорослого штаму, а в наступному – про втрату здатності швидко розмножуватися за пасажів через штучне живильне середовище [1, 2].

Відмічено, що наступні пасажі мікобактерій змінених форм через штучне живильне середовище з різним рН призводять до появи L-форм, та певний період зберігають здатність, реверсувати у вихідні кислотостійкі палички збудника туберкульозу бичачого виду [3].

Також відомо, що оптимальна температура для росту М. bovis на штучних живильних середовищах 37–38 °С, хоча вони можуть рости в діапазоні 36–39 °С. За кімнатної (18–22 °С) та підвищеної (45 °С) температури мікобактерії туберкульозу не ростуть [4].

Метою нашого дослідження було культивування патогенних штамів М. bovis за температури 37°С із рН 7,1, що додатково містить ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетат у масових концентраціях 0,1; 0,5; 1%.

Культивування та накопичення біомаси досліджуваних штамів M. bovis проводили на яєчному живильному середовищі, яке за складом було ідентичним стандартному, виготовленому ДП «Ветеринарна медицина» (Харків, Україна). До середовища додавали ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетат для отримання концентрацій 0,1%; 0,5%; 1%. Дослідження проводили зі встановленням рівню рН 7,1. Відмірювання необхідної кількості препарату проводили згідно з ГОСТ 27025-86. Розчини готували згідно методик, описаних у ГОСТ 4212-76 [5].

Висів мікобактерій, накопичених за температури культивування 37° С, у кількості двох бактеріологічних петель проводили на скошене живильне середовище в 10 пробірок з наступною інкубацією в термостаті (ТС-1/80 СПУ та ТСО-1/80 СПУ, Росія) впродовж трьох місяців за температури 37° С, зі щоденним спостереженням.

У виділених та накопичених мікобактерій вивчали тинкторіальні властивості, морфологічні ознаки, а також строки появи первинного росту, його інтенсивність і характер субкультури. Аналіз та оцінку колоній проводили за кількістю, величиною, формою, поверхнею, консистенцією, пігментоутворенням, прозорістю, блиском та емульгованістю у фізіологічному розчині [6]. Тинкторіальні властивості мікобактерій визначали, готуючи мазки із колоній (культур), зафарбованих за методом Ціля–Нільсена та досліджуючи їх під імерсією мікроскопа SUNNY серії XS із цифровим мікроскопічним комплексом «Микмед-2-1600» (Санкт-Петербург, Росія). Морфологію мікобактерій визначали за: довжиною, товщиною, формою, характером кінців клітин, зернистістю та розташуванням.

Гравіметричні вимірювання виконували на лабораторних електронних аналітичних вагах моделі ESJ-200-4 (США).

У таблиці 1 систематизовано дані про культуральні властивості M. bovis пасажу, який культивували на середовищі з рН 7,1, що додатково містить ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетат у трьох концентраціях.

До 7-ї доби досліду ріст культури пасажу M. bovis на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °С не відмічався.

Таблиця 1

Характеристика культуральних властивостей 100 пасажу M. bovis, культивованих на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °С

7-а доба досліду
Контроль	Концентрація ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату
	0,1%	0,5%	1%
Шорсткий наліт	За лінією посіву шорсткий наліт	Ріст відсутній	Ріст відсутній
14-а доба досліду
Контроль	Концентрація ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату
	0,1%	0,5%	1%
Шорсткий наліт та поодинокі білі колонії за лінією посіву	За лінією посіву шорсткий наліт	За лінією посіву шорсткий наліт	Ріст відсутній
30-а доба досліду
Контроль	Концентрація ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату
	0,1%	0,5%	1%
Суцільний ріст. Гладенькі, дрібні колонії білуватого кольору	Дрібні колонії білого кольору	За лінією посіву шорсткий наліт	Без змін
60-а доба досліду
Контроль	Концентрація ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату
	0,1%	0,5%	1%
Суцільний ріст. Гладенькі, дрібні колонії білуватого кольору	Дещо збільшилася кількість поодиноких дрібних колоній	Зміна кольору середовища, шорсткий наліт, з’являються мізерні поодинокі колонії	Ріст відсутній
90-а доба досліду
Контроль	Концентрація ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату
	0,1%	0,5%	1%
Суцільний ріст	Значна кількість поодиноких дрібних колоній	Значна кількість поодиноких дрібних колоній	Ріст відсутній

Результати табл.1 засвідчують відсутність росту культури M. bovis пасажу лише тільки при 1% концентрації ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату. При концентрації 0,1% відзначається поступовий ріст колоній, починаючи вже з 7-го дня досліду - за лінією посіву шорсткий наліт, на 30-у добу з’являються характерні колонії (поодинокі дрібні білого кольору), на 60-добу їх кількість збільшується і на 90-у добу досліду, визначаємо значну кількість поодиноких дрібних колоній.

При використанні 0,5% концентрації ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату на 7-у добу ріст колоній відсутній у порівняні з контролем - за лінією посіву шорсткий наліт. На 14-у та 30-у добу досліду за лінією посіву спостерігається шорсткий наліт, (у контролі - шорсткий наліт та поодинокі колонії білого кольору-14-а доба; суцільний ріст, гладенькі, дрібні колонії білуватого кольору-30-доба). На 60-у добу виявлена зміна кольору середовища, шорсткий наліт, з’являються мізерні поодинокі колонії, в той час як у контролі залишається суцільний ріст. На 90-у добу ріст колоній подібний при 0,1 та 0,5% концентраціях.

Аналізуючи 1% концентрацію ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату нами визначено відсутність росту патогенного штаму M. bovis пасажу протягом усього періоду досліду (90 діб), що свідчить про туберкулостатичну дію препарату.

Висновки:

1. Дослідження засвідчили, що ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетат при 1% концентрації пригнічує ріст і розвиток патогенного штаму M. bovis, культивованого на середовищі з рН 7,1 за температури 37 °С, що свідчить про туберкулостатичну його дію.

2. Низька концентрація (0,1 та 0,5%) препарату ізопропіл 2-(4-феніл-5-(тіофен-2-іл)-4Н-1,2,4-тріазол-3-ілтіо)ацетату на середовищі з рН 7,1 при температурі 37°С ріст патогенного штаму M. bovis пасажу не стримує.

Література

1. Ткаченко О. Швидкоростучі M. bovis у проблемі туберкульозу // Ветеринарна медицина України. – 2004. – № 7. – С. 14–17.

2. Поліморфізм і мінливість M. bovis швидко- та повільнорослих штамів / О.А. Ткаченко, М.В. Білан, В.В.Зажарський та інші // Ветеринарна медицина України. – 2009. – № 3. – С. 30–33.

3. Морфологічні особливості реверсії некислотостійких M. bovis у бактеріальну кислотостійку форму / О.А. Ткаченко, М.В. Білан, Л.О.Ковальова, О.Є. Галатюк, // Ветеринарна медицина України. – 2009. – №6. – С. 28–30.

4. Туберкулёз животных и меры борьбы с ним / Ю.Я. Кассич, А.Т. Борзяк, А.Ф. Кочмарский и др.; Под ред. Ю.Я. Кассича. // К.: «Урожай», 1990. – 340 с.

5. Реактивы. Методы приготовления растворов для колориметрического и нефелометрического анализа: ГОСТ 4212-76. – [Действует с 2008-05-01.]. – М.: Минхимпром, 2008. – 23 с.

6. Настанова по діагностиці туберкульозу / В. М. Манченко, З. Р. Троценко, М. С. Павленко та ін. – Київ, 1994. – 39 с.