ОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

УДК 615.326 + 543.544

Халиков Ш.Х., Шоев С.Х., Кадыров М.З.

Научно-исследовательский институт национального Университета,

Таджикистан

РАЦИОНАЛЬНЫЙ ПОДХОД К ПОЛУЧЕНИЮ ВИТАМИНА D₃ ИЗ

ПРИРОДНОГО МУМИЁ

В статье рассматривается выделение витамина D₃ (холекалциферо-ла) из природного бальзама - мумиё, использованием простейшых методов возгонки и спектрофотометрии против контроля при 500 нм. Идентич-ность и структурная особенность полученного витамина проверена с помощью хроматографии, масс-, ИК- спектрометрии и элементным анали-зом. Установлено, что полученное вещество из состава мумиё является холекалциферолом.

Ключевые слова: мумиё, органический экстракт, холекалциферол, хроматография, витамины, карбобензоксихлорид.

Мумиё в народной медицине известно более трёх тысяч лет и оно считается надежным лекарственным средством, излечивающим орга-низм от многих заболеваний. Врачеватели древности, начиная от Арис-тотеля и заканчивая Авиценной, использовали мумиё для лечения всех болезней, поэтому до сих пор оно считается наиболее эффективным и сложным лекарством. Все медицинские доводы о мумиё и результаты экспериментальной терапии свидетельствуют о том, что мумиё (осо-бенно среднеазиатское) обладает целебным действием при лечении рахита, переломов, ран, повреждений и заболеваний периферических нервов, мышц, повышает защитные силы организма, стимулирует реге-неративные процессы в ране и сокращает срок лечения и многие другие патологические процессы.

Следует отметить, что из-за богатого компонентного состава мумиё, механизм действия его на живой организм представляется весьма сложным и до конца не изученным. Результаты химических и спектральных анализов свидетельствуют о наличии, присутствующих в мумиё, боле 25-макро и микроэлементов, оксидов металлов и солей. Что касается органической составляющей мумиё, то она представляет собой комплекс различных простых и сложных соединений, включающих в себя такие функциональные группы, как гидроксильная, карбонильная, карбоксильная, аминная, а также сопряжённые ароматические и гетероциклические системы.

По части изучения органических компонентов проделаны значи-тельные работы и получены достоверные результаты по изучению ряда органических кислот, фосфолипидов, углеводов, белков, и других соеди-нений. Однако нет абсолютно ясной картины, подтверждающей присут-ствие бальзамических веществ, эфирных масел, стероидов, полифе-нолов, витаминов, порфиринов и гуминовых кислот, о которых инфор-мативно упоминается в некоторых сообщениях. Среди многочисленных исследований по мумиё, особое место занимают работы профессора Шакирова А.Ш. по D-витаминной активности мумиё [1]. Относительно выделения и исследования данного витамина в дальнейших сооб-щениях автора какие-либо оговорки отсутствуют.

Наш интерес к изучению органических соединений состава мумиё был связан с некоторыми его основополагающими свойствами, связан-ными со свойствами отдельных компонентов, придающие ему практи-чески полезные особенности. Ранее мы сообщали о выделении и исс-ледовании из мумиё 2-хлор-10 (3-диметиламинопропил) фенотиазина [2] (аминазина), некоторых аминокислот [3] и гормона тестостерона [4]. В данной работе сообщаем о выделении и идентификации витамина D₃ (холекалциферола) из мумиё.

После проведения ряда экспериментальных работ, удалось раз-работать схему химической обработки мумиё для определения в нём содержания витамина D. Необходимо было уточнить, что действительно присутствует ли в мумиё витамин D. Нужно было провести ряд качест-венных реакций характеризующих витамин D. Для этого в сухую про-бирку налили небольшое количество спиртового раствора экстракта мумиё и туда добавили немного раствора брома в хлороформе (1:60), раствор принял зелёновато-голубую окраску, свидетельствующую о на-личии в смеси витамина D. Опрыскивания хроматограммы этанольного экстракта мумиё хлороформным раствором пентахлорида сурьмы да-вало коричнево-синюю окраску, характерную витаминам группы D₃. Далее к спиртовому раствору экстракта мумиё добавили серную кис-лоту, раствор принял красный цвет. Для сравнения в качестве эталона использовали образец витамина D₂, который показал идентичные ка-чественные свойства. Установлено, что витамин D может связываться с липопротеидами и белками, образуя устойчивый комплекс. Для отде-ления его из комплекса необходима щелочная обработка или обработка дегидратирующей системой растворителей [5].

Исходя из этого, мы пришли к выводу, что витамин D в мумиё свя-зан с фосфолипидами, белками, аминокислотами и другими азотисты-ми основаниями в виде прочного комплекса. Для его разрушения, мумиё растворяли в 1М растворе NaHCO₃ и при интенсивном перемешивании (условия Шоттен-Баумана) прибавляли карбобензоксихлорид (C₆H₅CH₂ OCOCl) [6], чтобы связать компоненты разрушенного комплекса за счёт освободившихся первичных, вторичных аминов и других нуклеофильных групп. Перемешивание продолжали в течение 8-10 ч и экстрагировали эфиром для удаления избытка карбобензоксихлорида. Раствор под-кисляли 6н. HCl до рН 3-3.5. Выпавший маслообразный продукт экст-рагировали хлороформом. Хлороформ отгоняли, остаток подвергали возгонке под вакуумом в специально собранном приборе (рис.1). Полу-чили белые кристаллы в виде тонких игл с температурой плавления 84-86⁰С (прибор Boetus Германия) (лит. 86-87⁰С).

Рис. 1. Прибор для возгонки витамина D₃. Верхний часть (2) охлаждается.

Опрыскивание хромотограммы полученного витамина D₃ раство-ром пентахлорида сурьмы дает коричнево-синюю окраску, характерную для витаминов группы D. Эталоном для сравнения служил образец витамина D₂. Следует отметить, что возгонка витамина D₃ из мумиё, по-лученное после обработки 1М раствором NaHCO₃ в отсутствии карбо-бензокиси хлорида и подкислением соляной кислотой не увенчалось ус-пехом т.к. выход полученного витамина D₃ был незначительным. По фи-зико-химическим данным выделенное нами соединение соответствует витамину D₃ (холекальциферолу). Вывод о достоверности полученных результатов, а именно о наличии витамина D в мумиё, сделали также на основе рассмотрения УФ-; ИК- и масс-спектров. Вещества содержат ха-рактеристическую полосу поглощения С = О в области 1740-1715 см^-1. УФ - спектр 268 нм, + 33⁰C(с 1.3 СНСI₃) (Polomate - S, Германия).

Для достоверности мы использовали, альтернативный метод опре-деления количество витамина D₃ в мумиё. Для этого на хлороформный раствор этанольного экстракта мумиё подействовали хлоридом сурьмы (lll) для образования окрашенного продукта, необходимого для опреде-ления оптической плотности (D) раствора, служащего мерой для уточне-ния количества витамина D₃, который определяли на основе построен-ной калибровочной кривой.

Экспериментальная часть

1. Получение этанольного экстракта мумиё. К 2.5 г. мумиё получен-ного по методике [7] добавляли 8 мл этанола, перемешивали в течении 2 ч. и оставляли при комнатной температуре, нерастворившуюся часть отфильтровывали. Этанольную часть упаривали в вакууме на роторном испарителе, остаток высушивали в вакууме. Получали 0,84г. светло-коричневого гигроскопического порошка. В качестве растворителя можно использовать также метанол.

2. Возгонка витамина D₃. 1г мумиё растворили в 20мл 1М растворе NaHCO₃ и при интенсивном перемешивании (условия Шоттен-Баумана) прибавили 5 мл карбобензоксихлорид (C₆H₅CH₂OCOCl), чтобы связать компоненты разрушенного комплекса за счёт освободившихся первич-ных, вторичных аминов и других нуклеофильных групп. Перемешивание продолжали в течение 8-10 ч и содержимое экстрагировали 3 раза по 10 мл эфиром для полного удаления избытка карбобензоксихлорида. Раствор подкисляли 6н. HCl до рН 3-3.5. Выпавший маслообразный продукт экстрагировали хлороформом. Хлороформ отгоняли, остаток подвергали возгонке под вакуумом (2 мм Нg cт.) получили 23.25 мг 2.32% белых кристаллов в виде тонких игл с температурой плавления 84-86⁰С (прибор Boetus, Германия). Найдено в %: С 86.80, Н 9.38: Вы-числено в %: (C₂₇H₄₄O) C 86.40; Н.9.40. ТСХ анилиз витамина D₃ про-водили на силуфоле UV-254, R_f 0.84 (н. бутанол-уксусная кислота-вода, 4:1:1), R_f 0.66 (пиридин-изоамиловый спирт,1:1), R_f 0.94 (метанол-вода, 98:2). Зоны вещества первой половины хроматограммы проявляли парами йода. В масс-спектре обнаружены интенсивные пики ионов с m/z 384(C₂₇H₄₄O), 229(C₁₆H₂₁O), 124(C₈H₁₂O), 107(C₈H₁₁), 95(C₇H₁₁), 93(C₇H₉), 81(C₆H₉),79(C₆H₇). Опрыскивание второй половины хроматограммы раст-вором пентахлорида сурьмы давало коричневато-синюю окраску, харак-терную для витаминов группы D. Эталоном для сравнения служил витамина D₂, дающий аналогичную окраску.

3. Количественное определение витамина D₃. 0.84г. сухого этаноль-ного экстракта мумиё растворяли в 30мл эфира, добавляли осушитель сульфата натрия и высушивали в течения 30 мин, затем фильтровали через бумажный фильтр. Эфир отгоняли на водной бане, из сухого ос-татка брали 100 мг растворяли в 5 мл хлороформа, (20мг/мл) из получе-ного раствора отбирали 1 мл добавляли 3 капли ацетилхлорида и 6 мл раствор хлорида сурьмы (lll). Через 5-6 мин. измеряли оптическую плот-ность (интенсивность окраски) раствора на спектрофотометре СФ-26 при 500 нм в кюветах с толщиной слоя в 1 см против смеси из 1 мл хлороформа, 6 мл раствора хлорида сурьмы (lll) трёх капель ацетилхло-рида. Оптическая плотность (средняя) раствора соответствовала 0.51. Содержание витамина D₃ с оптической плотностью 0.51 рассчитывали по калибровочному графику (рис. 2), которому соответствовало 1,1 мг витамина D₃, на 5 мл исследуемого раствора, соответствовало 5.5 мг витамина D₃. Таким образом, в 1г мумиё содержится 25.2 мг витамина D₃, составляющего 2.52%.

4. Построение калибровочной кривой. Для получения калибровочного графика готовили серию растворов витамина D₃ в спирте. Для этого 20 мг витамина D₃ после возгонки растворяли в спирте в мерной колбе на 10 мл, с добавлением 0,5 мл раствора пентахлорида сурьмы. Раствор принимает коричнево - синюю окраску. Объём раствора довели до метки спиртом. Концентрация полученного раствора витамина D₃ составила 2 мг/мл. Путем разбавления исходного раствора каждый раз вдвое ( 5 мл предыдущего раствора пипеткой переносили в мерную колбу на 10 мл и доводили спиртом до метки) получали серию растворов витамина D₃ с концентрацией 2; 1; 0.5; 0.25; 0.125 и 0.0625 мг/мл.

Калибровочную кривую строили, откладывая значения оптической плотности растворов при 500 нм по оси координаты, и значение 2; 1; 0.5; 0.25; 0.125 и 0.0625 концентрации витамина D₃ по оси абсциссы.

Рис.2. Калибровочная кривая для определения витамина D₃

Выводы: 1) Используя простой метод возгонки, удалось выде-лить из сложного химического состава мумиё холекалциферол - вита-мина D₃.

2) Методом спектрофотометрии установлена достоверность полученных результатов.

ЛИТЕРАТУРА

1. А. Ш. Шакиров, В. К. Бауман, Е. В. Лузина, М.Ю. Валиниеце. Опре-деление D - витаминной активности мумиё, ДАН УзССР, № 5,45 - 47, (1986).

2. Ш.Х. Халиков, С.А. Алиева. Выделение и идентификация 2 - хлор - 10 - (3 - диметил - аминопропил) - фенотиазина из мумиё. Химия природных соединений № 1, 19-21 (2003).

3. С.Х. Шоев, Ш.Х. Халиков. Поиски свободных аминокислот в мумиё. Вестник Таджикского национального университета, серия Естест-венных наук - Душанбе, ½(81), 149-153, (2012).

4. C.Х. Шоев, Ш.Х. Халиков. Выделение и идентификация гормона тестостерона из мумиё. Республиканская конференции: «Перспек-тивы синтеза в области химии и технологии гетересоединений», г. Ду-шанбе, Таджикистан, Национальный Университет, Тезисы докл., (VI), 105 -107, (2012).

5. Н.F. De Luca, Recent advances in the metabolism and function of vitamin D. Fed. proc, 28,1678 (1969).

6. Bergmann, Zervas L., Ber. - Deut. Chem. Ges. 65, 1192 (1932).

7. Ю. Нуралиев, П. Денисенко. Монография, «Мумиё и его лечебные свойства». Ирфон, Душанбе, 1977, 110 (1997).