Дорошко О.В., Антонюк М.М.

Національний університет харчових технологій

Використання дріжджів родів Saccharomyces та Kluyveromyces у біотехнології 2-фенілетанолу

2-фенілетанол – вищий ароматичний спирт із характерним трояндовим ароматом, що знаходить широке застосування у різних галузях промисловості: харчовій, косметичній, парфумерній, фармацевтичній тощо [2]. На сьогодні світове виробництво 2-фенілетанолу становить приблизно 7 тис. тон/рік.

Фенілетиловий спирт можливо одержати шляхом екстрагування з рослинної сировини, наприклад, квітів гіацинту, жасмину, нарцисів, троянд та лілій [3]. Особливо цінним джерелом 2-фенілетанолу є ефірна трояндова олія, що містить до 60 % цього спирту. Однак, для екстрагування 2-фенілетанолу застосовують бензен або стерин, які володіють канцерогенними властивостями та небезпечні для довкілля [4].

Альтернативою хімічному синтезу є біотехнологічний спосіб одержання фенілетилового спирту з використанням різних культур мікроорганізмів, переважно – дріжджів. Серед бактерій здатність до синтезу 2-фенілетанолу виявлено у Microbacterium sp., Brevibacterium linens [2].

У літературних джерелах наявна інформація про можливість синтезу фенілетилового спирту мікроміцетами Phellinus ignarius, P. laevigatus, P. tremulae, а також Ischnoderma benzoinum і Geotrichum penicillatum [3]. Зокрема, вихід кінцевого продукту становив 280 мг/л для Ischnoderma benzoinum (тривалість культивування – 20 діб) та 0,0142 мг/л – для Geotrichum penicillatum(тривалість культивування – 99 год) [3].

Дослідниками встановлено, що на синтез 2-фенілетанолу мікроорганізмами суттєво впливає наявність у складі поживного середовища попередника – амінокислоти L-фенілаланіну. Так, Aspergillus niger CMICC 298302 продукував 1,375 мг/л цієї сполуки з 6 г/л L-фенілаланіну протягом 9 діб ферментації [3].

Біоконверсія L-фенілаланіну в фенілетиловий спирт (так званий шлях Ейрліха) виявилася ефективною і для дріжджів Saccharomyces cerevisiae, S. bayanus, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, Pichia fermentans, P. anomala, P. membranaefaciens, Candida utilis ін. [5]. Так, дріжджі Pichia fermentants L-5 здатні продукувати 0,453 г/л 2-фенілетанолу (16 год культивування) на поживному середовищі з 1 г/л L-фенілаланіну [6].

Внесення у середовище культивування L-фенілаланіну у концентрації 8 г/л та 0,5 г/л гліцеролу при вирощуванняі Yarrowia lipolytica протягом 54 год сприяло утворенню 0,77 г/л фенілетилового спирту. Амінокислота-попередник була утилізована культурою дріжджів вже через 24 год ферментації [1].

Найбільш важливими у промисловому виробництві 2-фенілетанолу є дріжджі родів Kluyveromyces та Saccharomyces. Це зумовлено їх високою синтезуючою здатністю при рості на дешевих субстратах – відходах різних виробництв (меляса, сироватка тощо).

Kluyveromyces marxianus CBS 600 за наявності у поживному середовищі 7 г/л L-фенілаланіну синтезував до 0,9 г/л фенілетилового спирту вже після 41 год культивування з використанням в якості джерела вуглецю меляси [4]. Перспективним продуцентом ароматичного спирту вважають також штам Kluyveromyces marxianus KY3, здатний окрім інших вуглеводів асимілювати й лактозу молока. Так, при культивуванні K. marxianus KY3 (температура 30 °С, концентрація L-фенілаланіну – 2,4 г/л) утворюється 0,4686 г/л 2-фенілетанолу [9]. При рості на поживному середовищі з глюкозою (концентрація 77 г/л) та у присутності попередника (7 г/л L-фенілаланіну) Kluyveromyces marxianus CBS 5670 здатний продукувати до 0,79 г/л L-фенілетанолу [10].

Вченими проведено ряд досліджень щодо визначення впливу умов культивування продуцентів на кінцеву концентрацію 2-фенілетанолу. Наприклад, у результаті підбору оптимальних умов культивування Kluyveromyces marxianus UCM Y-305 вдалося підвищити вихід цільового продукту з 0,0268 г/л до 0,37 г/л (концентрація попередника – 4 г/л). У процесі культивування дріжджів варіювали концентрацією сахарози, дріжджового екстракту, L-фенілаланіну, значенням температури, рН та рівнем аерації [7].

Оптимізація умов культивування різних штамів дріжджів S. cerevisiae УКМ Y-514 та S. cerevisiae УКМ Y-524 (5% сахарози; 0,75% дріжджового автолізату, 0,2 мг/л L-фенілаланіну) сприяла накопиченню кінцевого продукту у кількості 1,21 г/л [8]. Іншими дослідниками виявлена здатність культур S. cerevisiae NCYC та S. cerevisiae K-9 синтезувати до 1,5 г/л та 1,3 г/л 2-фенілетанолу відповідно [3].

Однак, як відомо, результати культивування дріжджів у лабораторних та промислових умовах суттєво відрізняються. Так, штам Saccharomyces cerevisiae Ye9-612 при культивуванні на поживному середовищі у колбах продукував лише 0,85 г/л цільової сполуки [2]. Досліджено, що вже після 72 год вирощування цієї ж культури дріжджів у біореакторі об’ємом 3 л, концентрація 2-фенілетанолу становила 4,5 г/л. На сьогодні даний показник є найвищим (не враховуючи виділення 2-фенілетанолу in situ в процесі біосинтезу) [2].

Досягнення такої високої концентрації фенілетилового спирту можна пояснити властивостями мікроорганізму та асоційованою з термотолерантністю стресостійкістю штаму. Вченими встановлено, що Saccharomyces cerevisiae Ye9-612 здатний продовжувати синтез 2-фенілетанолу навіть після досягнення у середовищі культивування критичного рівня концентрації даної сполуки, яка є токсичною для клітин мікроорганізму. Відомо, що для дріжджів Saccharomyces cerevisiae критична межа токсичності 2-фенілетанолу у середовищі становить 3-4 г/л [2].

Таким чином, серед біорізноманіття мікроорганізмів-продуцентів ароматичного спирту 2-фенілетанолу найперспективнішими і найбільш вивченими є дріжджі родів Kluyveromyces та Saccharomyces. Здатність даних мікроорганізмів до біотрансформації амінокислоти-попередника L-фенілаланіну у фенілетиловий спирт після всебічного вивчення може бути використана з промисловою метою у біотехнології одержання даної ароматичної сполуки.

Література

1. Celin´ska E., Kubiak P., Białas W. Yarrowia lipolytica: the novel and promising 2-phenylethanol producer // J. Ind. Microbial. Biotechnol. – 2013. – Vol. 40, №3. – P. 389-392.

2. Eshkol N., Sendovski M., Bahalul M. et al. Production of 2-phenylethanol from L-phenylalanine by a stress tolerant Saccharomyces cerevisiae strain // Appl. Microbiol. – 2009. – Vol. 106, № 4. – P. 534-542.

3. Etschmann M.M.W., Bluemke W.,. Sell D. Biotechnological production of 2-phenylethanol // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – Vol. 59, №4 – P. 1-8.

4. Etschmann M.M.W., Sell D., Schrader J. Screening of yeast for the production of the aroma compound 2-phenylethanol in a molasses-based media // J. of Biot. Lett. – 2003. – Vol. 25, № 3 – P. 531-536.

5. Fabre C.E., Blanc P.J., Goma G. Screening of yeasts producing 2-phenylethanol // Biotechnol. Tech. – 1997. – Vol. 11, № 7. – P. 523-525.

6. Huang C.J.R., Lee S.L., Chou C.C. Production and molar yield of 2-phenylethanol by Pichia fermentans L-5 as affected by some medium components // J. Biosci . Bioe ng. – 2000. – Vol. 90. – P. 142–147.

7. Mameeva O.G., Ostapchuk A.N., Nagornaya S.S. Analysis of the 2-phenylethanol production by yeasts genus Kluyveromyces // Мікробіологія і біотехнологія. – 2009. – Т.7, № 3. – С. 29-35.

8. Mameeva O.G., Ostapchuk A.N., Podgorsky V.S. The 2-phenylethanol and ethanol production by yeast Saccharomyces cerevisiae // Мікробіологія та біотехнологія. – 2010. – Т. 9, № 1. – С. 14-22.

9. Pat. 0040420 A1 USA. Flavour compound-producing yeast strains / Jui-jen Chang, Gheng-Yu Ho, Chieh-Chen Huang et al. – Publ. 16.02.2012.

10. Wittmann C, Hans M., Bluemke W. Metabolic physiology of aroma-producing Kluyveromyces marxianus // Yeast. – 2002. – Vol. 19, № 16. – P. 1351-1363.