ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ И БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ ФРУКТОВ И ОВОЩЕЙ

О.О. Бабич, К.В. Карчин, О.О. Шишко, С.А. Сухих, М.И. Зимина

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», Россия, Кемерово

В последнее время наблюдается значительное увеличение количества фруктов и овощей, вызывающих болезни пищевого происхождения. Свежие фрукты и овощи, листья, корни, луковицы и клубни, являются одними из самых скоропортящихся продуктов на рынках. Эти продукты богаты углеводами и бедны белками, имеют рН в диапазоне от 7,0 до слегка кислой среды и являются адекватной средой обитания для некоторых бактерий, дрожжей и плесени.

Минимально обработанные фрукты и овощи содержат наибольшее количество полезных веществ, но необходимо отметить, что минимальные методы обработки могут способствовать быстрому ухудшению физиологических, биохимических показателей и микробной деградации продукта, что может привести к ухудшению цвета, текстуры и вкуса. Сейчас известно множество способов продления срока годности фруктов и овощей (ультразвук, защитные покрытия, консервирование). Но в связи с постоянно растущим спросом на свежие и здоровые продукты потребители также стали более критично относится к использованию синтетических добавок для хранения продуктов питания. В связи с этим наиболее популярным способом продления срока годности продуктов является консервировани.

Существует много видов консервирования, но ни один из этих способов не осуществляется при использовании молочнокислых бактерий.

Эти микроорганизмы используются для замедления порчи и сохранения продуктов путем естественного брожения, они нашли применение в качестве заквасок в молочных продуктах, выпечке, при производстве мясных, овощных изделий и в ликероводочной промышленности.

Анализы способности молочнокислых бактерий к антимикробной активности были проведены на мясе, кисломолочных продуктах, сброженных овощах, молочных продуктах и рыбе. Некоторые штаммы молочнокислых бактерий способны продуцировать белковые соединения с антимикробным действием, которые известны как бактериоцины. Некоторые из них обладают высокой специфичностью, а другие обладают широким спектром антимикробного действия. Консервирующее действие молочнокислых бактерий на пищу и напитки объясняется совместным действием спектра антимикробных метаболитов, продуцируемых в процессе ферментации, таких как органические кислоты, диацетилвинную кислоту, пероксид водорода, бактериоцины. Эти компоненты не только оказывают воздействие на вкус, запах, цвет и текстуру пищи, но они также предотвращают развитие нежелательной микрофлоры. Таким образом, молочнокислые бактерии и их продукты дают ферментированным продуктам отличительный вкус, текстуру, предотвращают порчу, продлевают срок годности и ингибируют патогенные организмы.

При изучении микрофлоры свежих овощей были выделены 4 штамма микроорганизмов. Штамм Bacillus pumilus был выделен на сердечно-мозговом бульоне, штаммы Bacillus endophyticus, Bacillus stratosphericus strain, были выделены на молоке. Выделение штамма Bacillus subtilis проводили на среде МРС. Все штаммы показали оптимальный рост при 37°С.

При определении морфологических свойств выделенных штаммов, изучали такие показатели, как размер, форма и расположение клеток, наличие спор, отношение к окраске по Граму. Культуральные признаки определяют характером роста на питательных средах. Они являются важными диагностическими признаками, так как постоянны для каждого вида бактерий и по особенностям роста микроорганизмов на различных питательных средах можно предварительно, косвенно судить о видовой принадлежности микроорганизмов. Результаты изучения культуральных и морфологических свойств выделенных штаммов микроорганизмов представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Характеристика культуральных и морфологических признаков колоний штаммов изучаемых микроорганизмов

Показатели	Штаммы
	Bacillus stratosphericus strain	Bacillus endophyticus	Bacillus pumilus	Bacillus subtilis
Спорообразование	+	+	+	+
Подвижность	+	+	+	+
Форма	палочкооб-разная	палочкооб-разная	палочкооб-разная	палочкооб-разная
Характер контура края	бахромчатый	ровный	зубчатый	волнистый
Профиль	плоский	плоский	выпуклый	плоский
Поверхность	шероховатая	гладкая	гладкая	гладкая
Цвет	телесный	белый	белый	телесный
Структура	однородная	мелкозернистая	однородная	однородная
Консистенция	плотная	плотная	мягкая	плотная
Прозрачность	матовая	матовая	не прозрачная	матовая
Окраска по Граму	грамположительная	грамположительная	грамположительная	грамположительная

Все выделенные штаммы грамоположительные, имеют палочковидную форму, характерную для бактерий рода Bacillus. Клетки крупных размеров, размеры варьируются от 0,5-2,5 х 1,2-10 мкм, микроорганизмы являются аэробными спорообразующими бактериями. Расположение клеток различное - от одиночных до длинных цепочек.

Палочки подвижны за счет перетрихиальных жгутиков. Колонии плоские, выпуклые, неправильной формы, поверхность гладкая, у отдельных штаммов шероховатая. Колонии штаммов Bacillus endophyticus, Bacillus pumilus белого цвета, колонии других штаммов имеют телесный цвет. Структура однородная, у Bacillus endophyticus мелкозернистая. Контур края волнистый, зубчатый, у Bacillus endophyticus ровный. Консистенция колоний плотная, Bacillus pumilus имеет мягкую консистенцию. Колонии всех шаммов имеют матовую прозрачность, колонии штамма Bacillus pumilus не прозрачны.

Для полной идентификации провели микроскопирование на инверсионном микроскопе AxioVert.A1 Carl Zeiss AG, он позволяет более точно исследовать морфологические свойства живых клеточных культур. Программное обеспечение позволяет определить размер частиц, площадь, посчитать число колоний и сделать фотосъемку объекта. Фотографии выделенных штаммов приведены на рисунке 1.

А Б

В Г

Рисунок 1 – Штаммы микроорганизмов, выделенные из овощей: А - Bacillus pumilus, Б - Bacillus stratosphericus strain, В - Bacillus subtilis, Г - Bacillus endophyticus

Культуру получили из природного источника. Необходимо было провести идентификацию полученного штамма по морфологическим, культуральным и физиолого – биохимическим свойствам, для того чтобы изучить морфологические особенности данного штамма и определить к какому роду относится данная культура микроорганизмов. При определении морфологических свойств выделенных штаммов, изучали такие показатели, как размер, форма и расположение клеток, наличие спор, отношение к окраске по Граму. Культуральные признаки определяют характером роста на питательных средах. Они являются важными диагностическими признаками, так как постоянны для каждого вида бактерий и по особенностям роста микроорганизмов на различных питательных средах можно предварительно, косвенно судить о видовой принадлежности микроорганизмов, данные представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Дифференцирующие признаки выделенных штаммов

Показатели	Штаммы
	Bacillus stratosphericus strain	Bacillus endophyticus	Bacillus pumilus	Bacillus subtilis
Рост в молоке при температуре
30°С	+	+	+	+
37°С	+	+	+	+
45°С	-	+	-	-
Рост в бульоне MRS
30°С	-	-	-	+
37°С	-	+	-	+
45°С	-	-	-	-
Рост в сердечно-мозговом бульоне
30°С	+	-	+	+
37°С	+	-	+	+
45°С	-	-	-	-
Рост на агаризованных средах
РПА	+	-	+	+
МА	+	+	+	+
МРСА	+	+	+	+

Обозначения: + положительный результат;

- отрицательный результат

Анализируя данные, представленные в таблице 2, можно сделать вывод, что оптимальная температура для роста выделенных штаммов микроорганизмов составляет 30-37°С, при 45°С роста не наблюдается, либо он минимален. Все штаммы рода Bacillus растут в стерильном молоке при температуре 30-37°С, образовывая плотный сгусток. В бульоне MRS росли штаммы Bacillus endophyticus, Bacillus subtilis. В сердечно-мозговом бульоне наблюдался рост всех штаммов, кроме Bacillus endophyticus. При росте на жидких питательных средах наблюдается помутнение среды. При росте на агаре МРС, штаммы проявили слабый рост, образовывая одиночные редкие колонии. При культивировании бацилл на РПА наблюдался сплошной рост. Все штаммы росли на молочном агаре, но наблюдался слабый рост.

Изучение физиологических свойств микроорганизмов необходимо не только для того, чтобы наращивать биомассу. По условиям культивирования и составу среды можно определить отличительные признаки микроорганизма, используемые в таксономии, экологическую нишу, выяснить возможность его использования для решения практических задач. Наконец управление ростом культур лежит в основе биотехнологических процессов. Все это подчеркивает важность изучения характера роста и питательных потребностей бактериальных культур. Результаты исследования физиолого-биохимических свойств культур изучаемых микроорганизмов приведены в таблице 3.

Таблица 3 – Отличительные физиолого-биохимические признаки выделенных штаммов

№	Название	Штаммы
		Bacillus stratosphericus strain	Bacillus endophyticus	Bacillus pumilus	Bacillus subtilis
1	2	3	4	5	6
1	Глицерол	+	‒	‒	+
2	Эритрит	‒	‒	‒	‒
3	D-арабиноза	‒	‒	‒	‒
4	L-арабиноза	+	+	+	+
5	Рибоза	+	+	+	+
6	D-ксилоза	+	+	‒	+
7	L-ксилоза	+	‒	‒	‒
8	Рибит	+	‒	‒	‒
9	β-метил-ксилозид	‒	‒	‒	‒
10	Галактоза	‒	‒	‒	+
11	D-глюкоза	+	+	+	+
12	D-фруктоза	+	+	+	+
13	D-маноза	‒	+	+	+
14	L-сорбоза	‒	‒	‒	‒
15	Рамноза	+	+	‒	+
16	Галактит	+	‒	‒	‒
17	Инозитол	+	+	‒	‒
18	Манитол	+	+	+	+
19	Сорбитол	+	+	‒	‒
20	α-метил-D-манозид	+	‒	‒	‒
21	α-метил-D- глюкозид	+	+	‒	‒
22	N-ацетил-глюкозоамин	‒	+	‒	+
23	Амигдалин	+	+	‒	+
24	Арбутин	+	+	+	+
25	Эскулин	+	+	+	+
26	Салицин	+	‒	+	+
27	Целлобиоза	+	+	+	+
28	Мальтоза	+	+	‒	+
29	Лактоза	‒	‒	‒	+
30	Мелибиоза	‒	‒	‒	‒
31	Сахароза	+	+	+	+
32	Трегалоза	+	+	+	+
33	Инулин	‒	+	‒	‒
34	Мелицитоза	‒	‒	‒	‒
35	D-рафиноза	+	+	‒	‒
36	Крахмал	+	+	‒	‒
37	Гликоген	+	+	‒	‒
38	Ксилит	+	‒	‒	‒
39	β-генцибиоза	+	‒	+	+
40	D-тураноза	‒	‒	‒	‒
41	D-ликсоза	‒	‒	‒	‒
42	D-тагатоза	‒	‒	+	‒
43	D-фукоза	‒	‒	‒	-
44	L-фукоза	‒	‒	‒	‒
45	D-арабит	‒	‒	‒	‒
46	L-арабит	‒	‒	‒	‒
47	Глюконат	‒	‒	‒	+
48	2-кето-глюконат	‒	‒	‒	‒
49	5-кето-глюконат	‒	‒	‒	‒
50	Контроль	‒	‒	‒	‒

При анализе данных, представленных в таблице 3, можно сделать вывод, что все выделенные штаммы рода Bacillus сбраживают L-арабинозу, рибозу, D-глюкозу, D-фруктозу, манитол, арбутин, эскулин, целлобиозу, сахарозу, трегалозу. По потреблению других углеводов штаммы значительно различаются между собой.