Биологические науки/9. Биохимия и биофизика

К.б.н. Булякова Н.В., Азарова В.С.

Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, Россия

ВОССТАНОВЛЕНИЕ МЫШЦЫ И СОСТОЯНИЕ ТИМУСА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЛАЗЕРА НА АЛЛОПЛАСТИКУ МЫШЕЧНОЙ РАНЫ В ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ

В настоящее время одним из методов, применяемых в области регенеративной биологии и медицины, является метод тканевой (заместительной) терапии, позволяющий закрывать дефекты после травмы. При этом необходимо применение иммунодепрессантов, а также определенная подготовка организма реципиента или имплантата. В литературе описаны положительные результаты по применению низкоинтенсивного лазерного излучения в области трансплантологии [3, 4, 8]. В зависимости от дозы, области облучения и режима воздействия лазерное излучение может снижать дегенеративные изменения в поврежденных тканях, стимулировать регенерацию тканей и оказывать иммуномодулирующий эффект на организм реципиента, вызывать структурные изменения в тимусе и периферических лимфоидных органах [1, 2, 5, 6].

Цель данной работы – оценить структуру восстановленной мышцы и функциональное состояние тимуса у молодых, взрослых и старых крыс-реципиентов при аллопластике мышечного дефекта в различных условиях предварительного воздействия излучения He-Ne лазера.

Материал и методы исследования

Эксперимент проведен на беспородных крысах-самцах в возрасте 1-мес, 3–4-мес и 24–30-мес. В каждой возрастной группе животные были разделены на две подгруппы. У одних животных (12 крыс) обе задние конечности в области проекции икроножных мышц в течение двух недель подвергались предварительному курсовому воздействию лазерных лучей в дозе 4.5–5.4 Дж/см² на каждую конечность (632.8 нм, мощность 2.5–3 мВт/см², 10 экспозиций по 3 мин). Остальных 12 крыс не облучали. На следующий день после лазерного воздействия между двумя подгруппами животных была проведена перекрестная аллопластика. В результате, 1-я серия состояла из одномесячных, взрослых и старых крыс, которым в необлученную лазером перерезанную правую икроножную мышцу имплантировали облученную лазером измельченную мышечную ткань, извлеченную из левой предварительно облученной икроножной мышцы крысы-донора. И наоборот, 2-я серия состояла из аналогичных возрастных групп животных, которым в предварительно облученную лазером перерезанную правую икроножную мышцу было имплантировано некоторое количество необлученной лазером измельченной мышечной ткани, извлеченной из левой необлученной икроножной мышцы крысы-донора. Исследовали эффект имплантации аллогенной мышечной ткани в область травмы правой икроножной мышцы. Поскольку в каждой серии одно и то же животное было и донором, и реципиентом, генетические различия у животных обеих серий, т.е. варианты тканевой несовместимости в обеих сериях должны быть одинаковы.

Мышечные регенераты и тимус были исследованы через 30 сут после воздействия лазера и аллопластики дефекта в мышце. Для оценки состояния тимуса измеряли его относительную массу (% от массы тела), “методом полей” с помощью тестовой окулярной сетки определяли величину коркового слоя, а также митотический индекс тимоцитов в нем (МИ ‰) и число лимфоцитов, подвергавшихся кариопикнозу (%). Количественные данные обрабатывали статистически и различия средних величин оценивали по критерию Стьюдента.

Результаты исследований

Одномесячные крысята. У крыс в 1-й и 2-й сериях опытов на 30-е сут

пространство между обеими культями в перерезанной мышце реципиента практически полностью заполнялось регенерирующей мышечной тканью (рис.1 а, б; рис. 2 а, б). В области поперечной перерезки в мышце наблюдались мышечные волокна, растущие от обеих культей и формирование в области аллопластики сравнительно узких аллогенных мышечных волокон в результате регенерационной перестройки импланта. Мышечные волокна имели разный диаметр, располагались в дефекте беспорядочно. Между ними встречались клетки лимфоидной ткани.

б

б

Рис.1. (1-я серия). Рис. 2. (2-я серия).

Одномесячные крысята: а – общий вид 30-суточных регенератов, ув. х 7.5;

б – область травмы, которая в мышцах обеих серий опытов практически

полностью замещается регенерирующей мышечной тканью, ув. х 40.

При этом у молодых крысят к моменту завершения формирования мышцы (30 сут) в обеих сериях изученные показатели функции тимуса практически не отличались от соответствующих показателей в тимусе интактных крыс до операции (рис.3). Можно отметить только, что во 2-й серии (после воздействия излучения He-Ne лазера на подготавливаемую к операции мышцу) масса тимуса оставалась достоверно низкой по сравнению с интактными необлученными крысами-реципиентами перед операцией.

Взрослые крысы (3-4-месячные). В обеих сериях опытов аллопластика области травмы не оказывала заметного агрессивного влияния на состояние мышечной ткани реципиента. Однако область травмы (расстояние между

проксимальной и дистальной половинами мышцы) была сравнительно широкой. Через 30 сут после аллопластики отмечались мышечные волокна,

отрастающие по краю обеих мышечных культей, а также узкие

беспорядочно лежащие аллогенные мышечные волокна, рядом с которыми наблюдалось повышенное количество клеток лимфоидной ткани. Пространство между обеими культями в перерезанной мышце реципиента в 1-й серии примерно наполовину заполнялось регенерирующей мышечной тканью, во 2-й серии – примерно на 2/3 (рис.4 а, б; рис.5 а, б).

б

б

Рис.4. (1-я серия). Рис.5. (2-я серия).

Взрослые крысы: а – общий вид 30-суточных регенератов, ув. х 7.5; б – область травмы в мышцах, содержащая во 2-й серии большее количество регенерирующей мышечной ткани, чем в 1-й серии, ув. х 40.

Функциональная активность тимуса у взрослых крыс в обеих сериях опытов через 30 сут по многим изученным показателям достоверно отличалась от тимусов интактных необлученных крыс до операции, что указывает на неокончательное восстановление функции органа к данному сроку регенерации (рис.6). Причем, во 2-й серии масса тимуса у крыс-реципиентов в результате лазерного воздействия достоверно снижалась перед операцией и оставалась достоверно низкой к концу наблюдения по сравнению с животными в 1-й серии.

Старые крысы (24-30-месячные). В обеих сериях опытов аллопластика области травмы в скелетной мышце реципиента была мало эффективна.

Отмечалось уменьшение мышечной ткани в проксимальной и дистальной половинах мышцы, уплотнение септ и увеличение соединительной ткани в них. В 1-й и 2-й сериях (рис.7 а, б и рис.8 а, б) большая часть области травмы была заполнена соединительной тканью с жировым перерождением, тяжами гомогенных коллагеновых волокон, а также единичными узкими мышечными волокнами, отрастающими в некоторых местах от культей. Многие из них находятся в ишемическом состоянии, темно окрашены и подвергаются дегенеративным изменениям. Интерстициальное пространство по краю культей и в области травмы интенсивно инфильтрировано лимфоидными клетками.

б

б

Рис. 7. (1-я серия). Рис.8. (2-я серия).

Старые крысы: а – общий вид 30-суточных регенератов, ув. х 7.5; б – область травмы в мышцах, содержащая преимущественно рыхлую соединительную ткань с жировым перерождением, единичные узкие дегенерирующие мышечные волокна и множество лимфоидных клеток, ув. х 40.

Функциональная активность тимуса у старых крыс в обеих сериях опытов к концу наблюдения была значительно снижена (рис. 9). Сохранялась инволюция тимуса и лишь в некоторых тимусных дольках отмечались признаки восстановления коркового и мозгового слоев, что позволило провести, в целом, анализ показателей функционального состояния тимуса. На 30-е сут в обеих сериях опытов масса тимуса у крыс 1-й серии имела тенденцию к увеличению, а во 2-й серии – тенденцию к снижению по сравнению с тимусом интактных необлученных крыс до операции, а некоторые достоверные различия функциональных показателей указывают на продолжающиеся процессы восстановления в тимусах старых крыс. Так, при увеличении площади коркового вещества в дольках отмечался достоверно высокий пикноз лимфоцитов или тенденция к его увеличению

.

Такой же характер изменений наблюдался в тимусе предварительно облученных лазером крыс-реципиентов перед аллопластикой (2-я серия).

Таким образом, в условиях облучения He-Ne лазером мышечного аллопланта или мышц, в дефект которых предполагается имплантация аллогенной мышечной ткани, область повреждения в мышце заполняется регенерирующей мышечной тканью. Регенерирующая мышечная ткань состоит из мышечных волокон, растущих по краю обеих мышечных культей и узких аллогенных мышечных волокон, сформировавшихся в центре дефекта. Отмечается присутствие лимфоидных клеток. Не исключено формирование гибридных мышечных волокон, возможность образования которых была показана некоторыми исследователями ранее [5,7]. Более мышечный тип строения регенератов наблюдался у молодых крыс, с возрастом животного количество регенерирующей мышечной ткани снижалось.

В обеих сериях опытов к концу наблюдения полного восстановления функции тимуса не происходило. К тому же, при курсовом предварительном воздействии лазерных лучей на мышцы реципиента функциональная активность тимуса перед операцией снижалась. С возрастом животного эффект был выражен в большей степени.

Литература:

1. Баранов Г.А., Левин В.А., Новосадов А.М. и др. Патент 2209085 «Способ повышения антигенности и иммуногенности биоматериала», 2003 (Заявка: 2001117399/14 от 20.06.2001).

2.Глушкова О.В., Новоселова Е.Г., Черепков Д.А. и др. Эффекты облучения разных участков кожи мышей-опухоленосителей низкоинтенсивным лазерным светом // Биофизика. 2006. Т.51. №1. С.123-135.

3. Павлов А.В. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы регенерации костей свода черепа при ксенокраниопластике пластинами коралла. Автореф. дис. канд. мед. наук. Рязань. 2004. 117с.

4. Сапрыкина Е.С. Комплексная оценка эффективности применения аутогенных клеток стромы лимфатических узлов и лазерного излучения при коррекции лимфоидных отеков конечностей (экспериментальное исследование). Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов. 2009. 105с.

5.Харин Г.М. Изменения цитоархитектоники лимфоидных органов при воздействии на организм лазерного излучения // Применение лазеров в хирургии и медицине. Ч.1. М. 1989. С.567-569.

6. Gao X., Xing D. Molecular mechanisms of cell proliferation induced by low power laser irradiation. J Biomed Sci., 2009, v. 16, № 1, p. 4–20. doi:10.1186/1423- 0127-16- 4.

7. Heslop L., Beauchamp J.R., Tajbakhsh S. et al. Transplanted primary neonatal myoblasts can give rise to functional satellite cells as identified using the Myf5^nlacZI+ mouse. Gene therapy, 2001, v.8, № 10, p. 778– 783.

8. Walsh L.J. The use of laser in implantology: J.Oral. Implantol., 1992, v.18, №4, p.335-340.

9.Watt D.J., Lambert K., Morgan J.E., Partridge T.A., Sloper J.C. Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse. J. Neurological Sciences, 1982, v. 57, p. 319–331.