Беспалов В.Г., Коптева О.С., Киреева Г.С., Васильева И.Н., Майдин М.А., Семёнов А.Л., Вышинская Е.А., Красильникова Л.А., Стуков А.Н., Беляев А.М.

Поиск новых лекарственных препаратов для интраперитонеальной химиотерапии канцероматоза брюшной полости при раке яичника

ФГБУ "НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова" Минздрава России, Санкт-Петербург

Рак яичника (РЯ) является одним из самых агрессивных и тяжело поддающихся лечению онкологических заболеваний. Это первая по показателю летальности онкогинекологическая патология [10]. В России в 2013 году зарегистрировано 13262 новых случаев РЯ и 7713 смертей от него, прирост стандартизованного показателя заболеваемости за 10 лет составил 4,66% [2]. На момент установления диагноза РЯ у 65–70% больных имеется канцероматоз брюшной полости, в этом случае летальность в первый год с момента постановки диагноза составляет около 30%, а общая пятилетняя выживаемость – менее 25% [6]. В течение многих лет стандартом лечения больных с далеко зашедшими стадиями РЯ является хирургическая циторедукция с последующей внутривенной химиотерапией препаратами платины и таксанами [6, 12]. Неудовлетворительные результаты стандартного лечения требуют поиска новых подходов к лекарственной терапии больных с далеко зашедшими стадиями рака яичника.

В качестве альтернативы системной химиотерапии при РЯ сегодня рассматривается возможность внутрибрюшинного введения противоопухолевых препаратов или интраперитонеальная химиотерапия. Характерной особенностью рака яичника является имплантационный путь метастазирования путем эксфолиации опухолевых клеток с пораженной яичниковой ткани с распространением на париетальную и висцеральную брюшину, купол диафрагмы, большой и малый сальник [6], поэтому интраперитонеальная химиотерапия при этой локализации рака может быть более эффективной лечебной тактикой. При внутрибрюшинном введении можно добиться повышения концентрации лекарственного вещества в брюшной полости, большего проникновения его в опухолевую ткань и снижения системного токсического действия. Группа онкологической гинекологии США и другие авторы провели так называемые большие и малые рандомизированные клинические исследования у больных РЯ с канцероматозом брюшины, в которых цитостатические препараты в схемах полихимиотерапии вводили внутривенно и внутрибрюшинно через катетер; был сделан вывод о более высокой эффективности и менее выраженной токсичности интраперитонеальной химиотерапии по сравнению только с системным введением препаратов [9]. На основании данного вывода Национальный раковый институт США в 2006 г. рекомендовал использовать комбинированное внутривенное и внутрибрюшинное введение химиотерапевтических препаратов в лечении больных распространенными стадиями РЯ после оптимальной циторедуктивной операции, но специальный анализ показал, что в рутинной клинической практике такой вариант лекарственного лечения используется мало [7]. Это связано в том числе с тем, что лишь небольшое число противоопухолевых препаратов подходит для интраперитонеальной химиотерапии.

"Идеальный" препарат для интраперитонеальной химиотерапии должен обладать следующими характеристиками: 1) выраженное контактное противоопухолевое действие при непосредственном соприкосновении с опухолевыми клетками, 2) низкий молекулярный вес, 3) отсутствие в механизме действия метаболической активации, 4) способность сохранять значительную концентрацию в перитонеальной жидкости после внутрибрюшинного введения, 5) способность быстро проникать в опухолевые клетки, 6) низкие показатели местной и системной токсичности. Изученные сегодня для внутрибрюшинного введения противоопухолевые препараты не отвечают всем вышеназванным требованиям к "идеальному" препарату. Для интраперитонеальной химиотерапии необходим поиск новых препаратов, обладающих более выраженным контактным противоопухолевым действием, но при этом более безопасных.

Целью работы явилось изучение и сравнение противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов, применяемых в клинической практике для лечения РЯ – диоксадэта, цисплатина, митомицина С, мелфалана, паклитаксела, циклофосфана и гемцитабина – при их внутрибрюшинном введении на модели перевиваемого асцитного РЯ.

Материалы и методы

Исследование проведено на 80 крысах самках Вистар с начальной массой тела 200–260 г разводки питомника "Рапполово" РАМН (Ленинградская область). Крысы содержались в виварии барьерного типа в стандартных условиях. Содержание и все манипуляции с крысами проводились в соответствии с требованиями действующих стандартов по содержанию и использованию лабораторных животных. Крысы получали комбикорм для содержания лабораторных грызунов (ООО "Лабораторкорм", Москва) и питьевую водопроводную воду без ограничений. Использован штамм опухоли яичника, созданный перевивкой РЯ от крысы, подвергшейся трансплацентарному воздействию канцерогена; исходный гистологический тип опухоли – метастазирующая папиллярная аденокарцинома, в настоящее время – асцитная опухоль [1]. Штамм опухоли яичника был получен из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Использованы следующие противоопухолевые препараты: диоксадэт (Кемконсалт, Санкт-Петербург, Россия); цисплатин (Тева Фармацевтические Предприятия Лтд, Израиль); митомицин С (ЛЭНС-Фарм, Россия); мелфалан (ГлаксоСмитКляйн Мэньюфэкчуринг С.п.А., Италия); паклитаксел (Биокад, Россия); циклофосфан (Верофарм, Россия); гемцитабин (Лилли Франс С.А.С., Франция).

Крысы после внутрибрюшинной перевивки РЯ в количестве 1×10⁷клеток были рандомизированы на 8 групп по 10 крыс в группе: 1. Контроль – вводили физиологический раствор по 2 мл на крысу. 2. Диоксадэт – 1,5 мг/кг массы тела. 3. Цисплатин – 4 мг/кг. 4. Митомицин С – 1,5 мг/кг. 5. Мелфалан – 2 мг/кг. 6. Паклитаксел – 5 мг/кг. 7. Циклофосфан – 100 мг/кг. 8. Гемцитабин – 50 мг/кг. Физиологический раствор в контроле или препараты в опытных группах вводили внутрибрюшинно однократно через 48 часов после перевивки опухоли. Все цитостатики вводили в физиологическом растворе или в прилагаемом к препарату растворителе в ранее установленных максимально переносимых дозах. Противоопухолевые эффекты препаратов оценивали по увеличению медианы продолжительности жизни (МПЖ) в сравнении с контролем, которое рассчитывали в % по формуле:

МПЖО – МПЖК

УПЖ = ———————————— × 100,

МПЖК,

где МПЖО и МПЖК – соответственно МПЖ крыс опытной и контрольной группы.

Результаты эксперимента подвергали статистической обработке на персональном компьютере с помощью программы SPSS Statistics 17.0. Статистический анализ показателей выживаемости проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Проводили попарные сравнения двух независимых групп по одному признаку с помощью Log Rank (Mantel-Cox) теста. Различия считали статистически достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Опухоль яичника прививалась у 100% крыс, быстро прогрессировала, вызывая у всех крыс асцит и приводя к гибели животного. На вскрытии у крыс наблюдали асцит (в большинстве случаев геморрагический), канцероматоз висцеральной и париетальной брюшины, большого и малого сальника, брыжейки кишечника, метастатическое поражение лимфатических узлов брюшной полости, купола диафрагмы, печеночной связки. Результаты эксперимента представлены в таблице.

Таблица. Влияние препаратов при их внутрибрюшинном введении на медиану продолжительности жизни крыс после перевивки опухоли яичника (n=10 в каждой группе)

Группа	95% доверительный интервал по медиане, нижняя и верхняя граница		МПЖ, сутки (увеличение в сравнении с контролем, %)	p
I. Контроль	12	20	17
2. Диоксадэт	23	35	30 (76%)	<0,001 (1), =0,039 (4), <0,001 (8)
3. Цисплатин	22	40	32,5 (91%)	<0,001 (1), =0,022 (4), =0,038 (6), =0,030 (7), <0,001 (8)
4. Митомицин С	19	25	22 (29%)	=0,001 (1), =0,039 (2), =0,022 (3), =0,002 (5), <0,001 (8)
5. Мелфалан	23	51	37 (118%)	<0,001 (1), =0,002 (4), =0,007 (6), =0,009 (7), <0,001 (8)
6. Паклитаксел	17	29	24 (41%)	<0,001 (1), =0,038 (3), =0,007 (5), <0,001 (8)
7. Циклофосфан	23	29	26 (53%)	=0,001 (1), =0,030 (3), =0,009 (5), <0,001 (8)
8. Гемцитабин	5	11	8,5 (–50%)	=0,001 (1), <0,001 (2–7)

p – Log Rank (Mantel-Cox) тест, в скобках указана группа, с которой проводили сравнение.

Как видно из табл., 6 из 7 изученных препаратов статистически достоверно увеличивали МПЖ по сравнению с контролем (1 группа). Наиболее выраженные противоопухолевые эффекты наблюдались у мелфалана (5 группа), цисплатина (3 группа) и диоксадэта (2 группа), увеличение МПЖ после внутрибрюшинного введения которых составило соответственно 114, 88 и 79%; при этом достоверной разницы между 2, 3 и 5 группами не было, то есть эффективность диоксадета цисплатина и мелфалана была примерно одинаковой. Циклофосфан (7 группа), паклитаксел (6 группа) и митомицин С (4 группа) также достоверно увеличивали МПЖ по сравнению с контролем (1 группа), но лишь на 53, 41 и 29%, соответственно; при этом достоверной разницы между 4, 6 и 7 группами не было, то есть эффективность митомицина С, паклитаксела и циклофосфана была примерно одинаковой. Противоопухолевый эффект митомицина С был достоверно меньше, чем у диоксадэта, цисплатина и мелфалана; а паклитаксела и циклофосфана – достоверно меньше, чем у цисплатина и мелфалана. Гемцитабин (8 группа) достоверно уменьшал МПЖ по сравнению с контролем (1 группа) на 50%.

Противоопухолевую активность препаратов при их внутрибрюшинном введении могут определять такие факторы как молекулярная масса, соотношение содержания в перитонеальной жидкости по сравнению с плазмой (AUC), липофильные и гидрофильные свойства, необходимость метаболической активации, молекулярный механизм действия. Препараты с низкой молекулярной массой быстрее проникают в опухолевые клетки [11]. Молекулярная масса диоксадэта составляет 322, цисплатина – 300, митомицина С – 334, мелфалана – 334, циклофосфана – 279, и только паклитаксел имеет значительно большую молекулярную массу – 853 [5, 11, 14]. Низкая молекулярная масса диоксадэта, цисплатина и мелфалана способствует их быстрому проникновению в опухолевую ткань и, вероятно, имеет значение в более высокой эффективности при внутрибрюшинном введении. AUC диоксадэта, цисплатина, мелфалана и митомицина С имеют близкие значения от 12 до 65, AUC паклитаксела значительно выше и составляет 1000 [11, 14]. При более высоком AUC можно ожидать увеличения эффективности препарата при внутрибрюшинном введении в результате более длительной задержки в брюшной полости [11]. Однако на модели крыс с перевитой опухолью яичника паклитаксел не показал значительных преимуществ при внутрибрюшинном введении. Это можно объяснить как высокой молекулярной массой, так и особыми свойствами паклитаксела, связанными с его способностью формировать мицеллы, препятствующие связи с поверхностью опухолевых клеток [8]. Липофильность позволяет препаратам быстрее проникать внутрь клетки [11]. Цисплатин и митомицин С гидрофильны, диоксадэт сочетает липофильные и гидрофильные свойства, мелфалан и паклитаксел липофильны [3, 5]. Данные нашего исследования не подтверждают связи гидрофильных/липофильных свойств препаратов с противоопухолевой активностью при внутрибрюшинном введении. Можно предположить, что большая эффективность при внутрибрюшинном введении будет у препаратов, не требующих метаболической активации. Из изученных препаратов только митомицин С оказывает действие после метаболической активации. Препарат активируется в тканях с участием различных редуктаз с дитиольным активным центром [3]. Именно митомицин С проявил наиболее слабые противоопухолевые эффекты при внутрибрюшинном введении в нашей работе. Основные механизмы действия диоксадэта, цисплатина, мелфалана и циклофосфана связаны с алкилированием ДНК; митомицин С нарушает структуру и функцию ДНК, непосредственно связываясь с ней; паклитаксел стимулирует образование и стабилизацию микротрубочек, что вызывает остановку митоза [3, 5]. По-видимому, для интраперитонеальной химиотерапии наиболее подходят препараты с алкилирующим механизмом действия, низкой молекулярной массой и не требующие метаболической активации, такие как диоксадэт, цисплатин и мелфалан.

Особого объяснения требует не только отсутствие противоопухолевого действия гемцитабина при его внутрибрюшинном введении, но даже статистически значимое уменьшение МПЖ крыс с перевитой опухолью яичника. Ранее нами в экспериментах на мышах с перевитой асцитной опухолью Эрлиха было установлено, что гемцитабин, вводимый внутрибрюшинно, обладает противоопухолевым действием [4]. Аутопсия погибших крыс с перевитой опухолью яичника после внутрибрюшинного введения гемцитабина показала, что у них наблюдается выраженное кровотечение в брюшную полость при слабом накоплении асцита, вызванного канцероматозом брюшины. На данной модели гемцитабин давал выраженный побочный эффект – геморрагию в брюшную полость. Для гемцитабина характерно угнетение образования тромбоцитов, быстрое развитие тромбоцитопении и уменьшение свертываемости крови [13]. Вероятно у крыс с перевитой опухолью яичника, у которых и так, как было сказано выше, развивается геморрагический асцит, при внутрибрюшинном введении гемцитабина побочный эффект на свертываемость крови является критическим, что приводит к быстрой гибели животных и не дает проявиться противоопухолевой активности данного препарата.

Из трех наиболее эффективных в нашем исследовании препаратов – мелфалана, цисплатина и диоксадэта – наиболее благоприятным профилем токсичности обладает диоксадэт. Мелфалан обладает выраженной миелотокичностью; цисплатин – миело-, нефро-, нейро- и ототоксичностью, тогда как у диоксадэта отмечается только умеренно выраженная миелотоксичность, и в отличие от цисплатина, он не вызывает спаек в брюшной полости [3, 5]. Диоксадэт рекомендуется для клинических испытаний и внедрения в клиническую практику с целью лечения канцероматоза брюшной полости в виде интраперитонеальной химиотерапии у больных с далеко зашедшими стадиями РЯ.

Заключение

Проведено изучение и сравнение противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов диоксадэт, цисплатин, митомицин С, мелфалан, паклитаксел, циклофосфан и гемцитабин на модели канцероматоза брюшной полости, вызванного перевивкой асцитной опухоли яичника, у 80 крыс самок Вистар. Опухоль яичника перевивали крысам внутрибрюшинно в количестве 1×10⁷клеток. Препараты вводили внутрибрюшинно однократно через 48 часов после перевивки опухоли в максимально переносимых дозах. Противоопухолевые эффекты лечения оценивали по увеличению медианы продолжительности жизни (МПЖ) в сравнении с контрольными крысами, которым вводили физиологический раствор. Наиболее выраженное противоопухолевое действие оказали мелфалан, цисплатин и диоксадэт, которые статистически достоверно увеличивали МПЖ соответственно на 118, 91 и 76%. Циклофосфан, паклитаксел и митомицин С достоверно увеличивали МПЖ соответственно на 53, 41 и 29%. Гецитабин вызывал внутрибрюшные кровотечения у крыс и достоверно уменьшал МПЖ на 50%. По показателям эффективности и безопасности наиболее оптимальным для интраперитонеальной химиотерапии представляется диоксадэт, который рекомендуется для клинических испытаний у больных с диссеминированным РЯ. Внедрение в клиническую практику интраперитонеальной химиотерапии диоксадэтом позволит увеличить выживаемость и улучшить качество жизни больных с далеко зашедшими стадиями РЯ.

Литература

1. Беспалов В.Г., Беляева О.А., Киреева Г.С. и др. Интраперитонеальное химиоперфузионное лечение диссеминированного рака яичника диоксадэтом в сравнении с цисплатином в эксперименте // Сиб. онкол. журнал. – 2014. – № 2. – С. 14–18.

2. Злокачественные новообразования в России в 2013 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. – М.: "МНИОИ им. П.А. Герцена" Минздрава России. – 2015. – 250 с.

3. Корман Д.Б. Мишени и механизмы действия противоопухолевых препаратов. – М.: практическая медицина, 2014. – 336 с.

4. Латипова Д.Х., Гершанович М.Л., Стуков А.Н. и др. Синергизм противоопухолевой активности гемцитабина и диоксадэта у мышей с асцитной опухолью Эрлиха // Вопр. онкол. – 2011. – Т. 57, № 6. – С. 767–770.

5. Стуков А.Н., Гершанович М.Л., Бланк М.А. и др. Противоопухолевые лекарственные средства. – СПб.: NIKA, 2011. – 652 с.

6. Урманчеева А.Ф., Кутушева Г.Ф., Ульрих Е.А. Опухоли яичника (клиника, диагностика и лечение). – СПб.: Изд-во Н-Л, 2012. – 68 с.

7. Bowles E.J., Wernli K.J., Gray H.J. et al. Diffusion of intraperitoneal chemotherapy in women with advanced ovarian cancer in community settings 2003–2008: the effect of the NCI clinical recommendation // Front. Oncol. – 2014. – Mar 10; 4:43.

8. Echarri Gonzalez M.J., Green R., Muggia F.M. Intraperitoneal drug delivery for ovarian cancer: why, how, who, what, and when? // Oncology. – 2011. – Vol. 25. – P. 156–165.

9. Eskander R.N., Cripe J., Bristow R.E. Intraperitoneal chemotherapy from Armstrong to HIPEC: challenges and promise // Curr. Treat. Options Oncol. – 2014. – Vol. 15. – P. 27–40.

10. Ferlay J., Soerjomataram I., Ervik M. et al. GLOBOCAN 2012 v. 1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase № 11. Электронный ресурс. URL: http://globocan.iarc.fr/Default.aspx (дата обращения: 20.02.2015).

11. Hasovits C., Clarke S. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of intraperitoneal cancer chemotherapeutics // Clin. Pharmacokinet. – 2012. – Vol. 51. – P. 203–224.

12. Marcus C.S., Maxwell G.L., Darcy K.M. et al. Current approaches and challenges in managing and monitoring treatment response in ovarian cancer // J. Cancer. – 2014. – Vol. 5. – P. 25–30.

13. Wong A., Soo R.A., Yong W. et al. Clinical pharmacology and pharmacogenetics of gemcitabine // Drug Metab. Rev. – 2009. – Vol. 41. – Р. 77–88.

14. Yan T.D., Cao C.Q., Munkholm-Larsen S. A pharmacological review on intraperitoneal chemotherapy for peritoneal malignancy // World J. Gastrointest. Oncol. – 2010. – Vol. 2. – P. 109–116.