Бондаренко Т.А., Жегунов Г.Ф.

Харьковская государственная зооветеринарная академия

Роль времени инкубации глицерина с эритроцитами лошади на их сохранность после криоконсервирования

В ветеринарной практике для лечения животных широко используют методы трансфузии донорской крови. В последнее время в значительной мере возросло число научных исследований, посвященных проблемам низкотемпературного консервирования различных клеточных суспензий тканей и органов животных с целью их длительного хранения и использования для лечения.

В работе [1] показано, что проникающие (глицерин, ДМСО) и непроникающие (ПЭО-1500) криопротекторы по-разному влияют на эритроциты млекопитающих. Было установлено, что при замораживании до -196 ⁰С эритроцитов животных (собаки, быка и лошади) ПЭО-1500 обеспечивает 95% сохранность клеток, ДМСО 75% сохранность, а глицерин лишь 25% сохранность. То есть, проникающий криопротектор глицерин был не способен обеспечить защиту эритроцитов млекопитающих при низкотемпературном консервировании при инкубации в течение 20 мин. перед замораживанием. Однако не было изучено более длительное инкубирование эритроцитов с глицерином.

Целью настоящего исследования было изучение влияния времени инкубации глицерина с эритроцитами лошади на сохранность клеток после криоконсервирования.

Объектом исследования служила кровь лошади. Для стабилизации крови применяли 4% цитрат натрия. Все животные были здоровыми половозрелыми самцами (5-10 лет). Кровь забирали из яремной вены.

Для удаления плазмы и лейкоцитов кровь центрифугировали 10 мин при 1200 g. Осадок эритроцитов трижды отмывали четырехкратным объемом изотонического раствора NaCl (150 мМ NaCl, 10 мМ фосфатный буфер рН 7,4).

Для криоконсервирования эритроцитов был использован глицерин по прописи ЦОЛИПК 11₄ (30% глицерин, 4% маннит, 0.7% NaCl, 0.03% Na₂HPO₄*H₂O рН=7,4) [2]. Криопротектор добавляли к эритроцитам при комнатной температуре в соотношении 1:1 (по объему) по каплям со скоростью 10 мл/мин. Время инкубации эритроцитов варьировали в пределах от 20 до 180 мин.

Взвесь клеток замораживали в стандартных пластиковых контейнерах объемом 1.5 мл. Замораживание осуществляли до температуры -196 ⁰С путем быстрого погружения контейнера в жидкий азот. Оттаивание производили на водяной бане при температуре 42-45 ⁰С с постоянным покачиванием контейнера.

При использовании проникающих криопротекторов эритроциты после размораживания необходимо отмывать. Согласно стандартным методикам для эритроцитов человека [3] проводилась троекратная отмывка. Криопротектор удаляли из эритроцитов методом последовательного центрифугирования.

Размороженную суспензию эритроцитов с криопротектором центрифугировали в течение 5 мин при 1200 g, надосадок удаляли. К осадку добавляли равный объем первого сахарозно - солевого отмывочного раствора. Взвесь клеток центрифугировали. Надосадок удаляли. Вторую и третью отмывку проводили аналогичным образом. Схема отмывок представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Состав растворов для отмывания размороженных эритроцитов.

Этапы отмывания	Сахарозно-солевая среда
Первый	30.0% сахароза, 0.7% NaCl, 10 мМ фосфатный буфер рН=7.4
Второй	10.0% сахароза, 0.7% NaCl, 10 мМ фосфатный буфер рН=7.4
Третий	5.0% сахароза, 0.9% NaCl, 10 мМ фосфатный буфер рН=7.4

Устойчивость деконсервированных эритроцитов определяли по уровню гемолиза спектрофотометрическим способом. На рис.1. показано, что при инкубации эритроцитов лошади в течение 20 мин. процент гемолиза составляет72%. При увеличении времени инкубации процент гемолиза деконсервированных эритроцитов снижается до 33 % (время инкубации 150 мин). При дальнейшем увеличении времени инкубации наблюдается возрастание процента гемолиза.

Рис. 1. Уровень гемолиза деконсервированных эритроцитов в зависимости от времени инкубации.

Таким образом, показано, что глицерин всё-таки способен обеспечить достаточно хорошую защиту эритроцитов лошади при низкотемпературном консервировании, если время инкубации перед замораживанием составляет 150 мин.

Литература:

1. Денисова О.М. Кріочутливість еритроцитів різних видів ссавців: Автореф. дис…канд.біол.наук - Харків, 2006,- 20 с.

2. Гаврилов О.К., Аграненко В.А. Методы долгосрочного хранения в замороженном состоянии эритроцитов, предназначенных для трансфузии: Метод. рекомендации.- М.: Медицина, 1980.-35 с.

3. Цуцаева А.А., Аграненко В.А. Криоконсервирование клеточных суспензий. - Киев: Наук.думка, 1983. – 240 с.