Метаболический статус лейкоцитов больных диабетической нефропатией
В условиях длительной
гипергликемии могут меняться метаболические процессы в клетках крови. Нашими исследованиями
установлены нарушение перекисного
окисления и ядерных белков лейкоцитов крови больных сахарным диабетом типа I и пиелонефритом [1,2].
Высказано предположение о роли молекул адгезии лейкоцитов в развитии ретино- и
нефропатии [3].
Целью настоящего исследования
явилось изучение процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) антиоксидантной защиты (АОЗ) и состояния ядерных белков
хроматина в лейкоцитах крови больных диабетической нефропатией. Больные были
разделены на следующие группы: больные СД типа I, без диабетической нефропатии
(ДН0) – 19 человек, больные СД типа I, диабетическая
нефропатия 1 стадии – 20 человек,
больные СД типа I, диабетическая
нефропатия 2 стадии – 21 человек, больные СД типа II, ДН0 –19 человек, больные
СД типа II, диабетическая нефропатия 1
стадии – 22 человека, больные СД типа II,
диабетическая нефропатия 2 стадии – 17 человек. В контрольную группу
вошло 25 практически здоровые люди -
первичных доноров.
Забор
крови для биохимических исследований осуществляли венопункцией
в утренние часы для избежания влияния
циркадных ритмов. Кровь стабилизировали гепарином. Плазму отделяли от
эритроцитов центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин.
Гепаринизированную кровь (20 ед/мл)
центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин Собирали
верхний слой клеток, содержащий лейкоциты
Примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония Лейкоциты
дважды отмывали фосфатным буфером. Для
определения биохимических показателей
использовали 1-2 млн
клеток (предварительно подсчитывали их количество в камере Горяева).
В лейкоцитах определяли содержание фракций гистонов по
методу [4]. Содержание
первичных продуктов перекисного окисления липидов – диеновых
конъюгатов (ДК) определяли по методу [5] путем прямой
регистрации в ультрафиолетовой области спектра после их экстракции смесью
гептана и изопропранолола (1: 1). Результаты выражали
в нмоль/мл.
Уровень конечных продуктов - шиффовых
оснований (ШО) в лейкоцитах определяли по методу Е.И. Львовской
и соавт. [6]. Для этой цели
гексановый экстракт измеряли при длинах волн 220 нм
и 400 нм. Отношение Е400/Е220
– об уровне шиффовых оснований.
Результаты выражали в условных единицах.
Содержание
вторичного продукта перекисного окисления липидов – малонового диальдегида в лейкоцитах
крови определяли в реакции с тиобарбитуровой кислотой
по методу [7]. При расчете использовали коэффициент молярной экстинкции, равный
1,56 10 5 М -1 см –1, единицы измерения – мкмоль/мл.
Характеристика
системы антиоксидантной защиты основывалась на определении
мембраносвязывающего фермента - каталазы (КАТ) в
плазме крови по методу М.А. Королюк и соавт. [8]. Активность каталазы оценивали по скорости разрушения перекиси водорода при 410
нм и выражали в нмоль Н2О2
/мл/мин.
Активность
аденозиндезаминазы (АДА) в эритроцитах определяли по методу И.Б. Немечек и соавт. [9]. Активность фермента оценивали по скорости
убывания аденозинмонофосфата натрия и выражали в нмоль аденозина/мл /мин. Аденозиндезаминазы не является собственно ферментом
АОЗ, тем не менее, нарушение метаболизма адениловых
нуклеотидов имеет непосредственное отношение к развитию пероксидного
стресса, в частности через реакцию гипоксантин – ксантиноксидазы.
Результаты обрабатывали методом
вариационной статистики.
В таблице 1 приведены результаты
определения показателей перекисного окисления липидов и ферментов антиоксидантной защиты в лейкоцитах крови больных сахарным
диабетом и на фоне диабетической нефропатии.
В
лейкоцитах крови больных сахарным диабетом типа I с диабетической нефропатией I стадии содержание ДК
и МДА превышало достоверно таковой контроля, соответственно, в 16.5
и 7.8 раза. Сопоставление со значениями аналогичных показателей у больных СД
типа I без диабетической нефропатии выявило отчетливую тенденцию к
увеличению содержания ДК и МДА в лейкоцитах крови больных СД типа I с ДН I стадии.
Также в лейкоцитах крови больных СД типа I с ДН I стадии
достоверно возросло содержание ШО как по сравнению с контролем, так и таковым
больных без ДН, соответственно, в 1.7 и 1.6 раза, соответственно.
В
лейкоцитах крови больных СД типа I с ДН I стадии достоверно возросла активность АДА как по
сравнению с контролем, так и таковым больных без ДН, соответственно, в 11.8 и
2.7 раза, соответственно. В лейкоцитах
крови больных СД типа I с ДН I стадии активность КАТ достоверно превышала значение
контроля на 53%.
В
лейкоцитах крови больных СД типа I с ДН II стадии зафиксирован достоверный рост содержания
ДК, МДА и ШО как по сравнению с
контролем, так и с аналогичными показателями двух предыдущих групп. Обращает на
себя внимание достоверное снижение активности АДА и КАТ в лейкоцитах крови
больных СД типа I с ДН II стадии по сравнению с таковыми предыдущих групп, а в
случае КАТ – ниже контроля.
В
лейкоцитах крови больных СД типа II с ДН I стадии наблюдалась тенденция к снижению содержания ДК
по сравнению с аналогичным показателем предыдущей группы, но сохранялись достоверные различия с контролем. Содержание
МДА в лейкоцитах крови больных СД типа II с ДН I стадии
достоверно превышали контроль в 8.8 раза. В тоже время содержание ШО в лейкоцитах крови больных этой группы было
сопоставимо с контролем. Активность АДА в лейкоцитах крови больных этой группы
достоверно превышала контроль в 11.8 раза, тогда как активность КАТ была ниже
контроля на 72%.
В
лейкоцитах крови больных СД типа II с ДН II стадии сохранялась тенденция к снижению содержания ДК
по сравнению с аналогичными показателями предыдущих групп, но сохранялись достоверные различия с контролем. Содержание
МДА в лейкоцитах крови больных СД типа II с ДН II стадии
достоверно превышали контроль в 16.2 раза. Содержание ШО в лейкоцитах крови больных этой группы
возрастало и превышало контроль в 2.1 раза. Активность АДА в лейкоцитах крови
больных этой группы достоверно превышала контроль в 7.3 раза, тогда как
активность КАТ была ниже контроля в 3.2 раза
Таблица 1.
Показатели перекисного окисления, активность ферментов аденозиндезаминазы
и каталазы в лейкоцитах крови больных сахарным диабетом и на фоне диабетической
нефропатии (Х± m)
|
Группы |
ДК, М-6 |
МДА, нмоль |
ШО, усл. ед |
АДА, мкмоль аденозина/мл/мин |
КАТ, М-6
Н2О2 |
|
Контроль,
n =25 |
30.3± 0,56 |
1,55± 0,22 |
0,09± 0,002 |
0,57±0,061 |
25,75±6,38 |
|
Больные СД типа I, ДН0, n =19 |
402.03+
11.25* |
3.6+
0.21* |
0.097+
0.005 |
2.47+
0.25 |
32.0+
0.646 |
|
Больные СД типа I, ДН 1 стадии, n =20 |
599.6+
2.52*# |
12.2+
0.95*# |
0,159+
0.003* |
6.72+
0.46* |
39.4+
0.995* |
|
Больные СД типа I, ДН 2 стадии, n =21 |
699,4+
10.3*#^ |
38,5+
1.34*#^ |
0.28+
0.008*#^ |
2.96+
0.34*# |
15.0+
0.928*#^ |
|
Больные СД типа II, ДН0, n =19 |
467.9+
4.67* |
10+
0.68* |
0.086+
0.005 |
5.2+
0.126* |
20.0+
0.889 |
|
Больные СД типа II, ДН 1 стадии, n =22 |
365.5+
3.18*# |
13.7+
0.49* |
0.098+
0.003 |
6.7+
0.347* |
15.0+
0.635* |
|
Больные СД типа II, ДН 2 стадии, n =17 |
219,78+
6.46*#^ |
25.2+
023*#^ |
0.19+
0.0056*#^ |
4.14+
0.257*# |
8.0+
0.978*#^ |
|
* -
достоверность различий по сравнению с контролем, р< 0.05 и ниже; #-
достоверность различий по сравнению с показателями группы СД с ДН0, р< 0.05 и ниже; ^
достоверность различий по сравнению с показателями группы СД с ДНI, р< 0.05 и ниже; |
|||||
Следовательно, у больных СД
типа I степень аккумуляции продуктов ПОЛ в
лейкоцитах крови возрастала в зависимости от стадии диабетической нефропатии. В тоже время, у
больных СД типа II степень аккумуляции
продуктов ПОЛ в лейкоцитах крови была наиболее выраженной у лиц с диабетической нефропатией II стадии.
Выявлен различный характер изменения активности аденозиндезаминазы
и каталазы в лейкоцитах крови больных СД в зависимости от наличия и стадии ДН.
В
лейкоцитах крови больных сахарным диабетом и диабетической нефропатией
наблюдалась выраженная декомпозиция соотношения нуклеосомных
гистонов: увеличение гистонов Н2A, H3, H4, гистонов Н2В при синхронном снижении гистона Н1 по
сравнению с таковыми контроля (таблица
2). При сохранении единого тренда
изменения соотношения нуклеосомных гистонов и линкерного
гистона Н1 было более выражено у лиц с сахарным
диабетом и диабетической нефропатией.
Наши исследования показали,
что в лейкоцитах крови больных сахарным диабетом происходит активация ПОЛ и
развивается декомпозиция нуклеосомных гистонов и гистона Н1.
Причиной декомпозиции гистонов, прежде всего, может быть токсичные продукты
ПОЛ, главным образом альдегиды. Это
может привести к повреждению гистонов, нарушению их взаимодействия с ДНК и изменение пространственной
организации хроматина. Снижение доли гистона Н1,
являющегося основным эндогенным ингибитором репликации и транскрипции, может
привести к экспрессии на мембране лейкоцитов молекул адгезии и других
поверхностных молекул, присутствие
которых обуславливает агрегацию лейкоцитов.
Таблица 2.
Соотношение нуклеосомных гистонов лейкоцитах
крови больных сахарным диабетом и на фоне диабетической нефропатии
|
Группы |
Н1 |
H2A,H3,H4 |
H2B |
|
Контроль,
n =25 |
38% |
46% |
16% |
|
Больные СД типа I, ДН0, n =19 |
20% |
52% |
28% |
|
Больные СД типа I, ДН 1 стадии, n =20 |
12%* |
54% |
34% |
|
Больные СД типа I, ДН 2 стадии, n =21 |
4%* |
56%* |
40% |
|
Больные СД типа II, ДН0, n =19 |
28% |
52% |
20% |
|
Больные СД типа II, ДН 1 стадии, n =22 |
20%* |
54% |
26% |
|
Больные СД типа II, ДН 2 стадии, n =17 |
15%* |
55%* |
30% |
Другим, не менее значимым
следствием активации ПОЛ в лейкоцитах является установленное нами изменение
физико-химических характеристик их
мембран, что также способствует более легкой агрегации этих клеток. К тому же выраженная
внутриклеточная активация ПОЛ существенно меняет метаболический статус этих
клеток.
Таким образом, полученные нами
данные показали возможный механизм влияния нарушения ПОЛ на причины агрегации
лейкоцитов при формировании ДН при сахарном диабете.
1.Молотов-Лучанский В.Б., Клюев Д.А., Муравлева Л.Е., Силаев Д.А.
Ядерные белки лейкоцитов и оксид азота у больных с инсулинзависимым
сахарным диабетом и хроническим пиелонефритом //Материалы международной научно-практической
конференции «Актуальные проблемы организации здравоохранения, клинической и
экспериментальной медицины», посвященной 100-летию со дня рождения П.М.
Поспелова - Караганда, 2003, С. 442-443
2.Клюев Д.А., Молотов-Лучанский
В.Б. Состояние хроматина лейкоцитов и содержание NO
в крови больных ИЗСД и хроническим пиелонефритом
//Новые технологии ХХI века в медицине: Материалы Российско-Казахстанского международного
семинара– Караганда,
2003.- С.
47-49.
3. Yang X. D., Michie S A, Mebius R E, et al.
The role of cell adhesion molecules in the development ofIDDM:
implications for pathogenesis and therapy. Diabetes,
1996, 45, 705-710
4. Маркушева Л. И., Савина M.
И., Решина В. M., Тогузов
Р. Т. Ядерные белки хроматина в оценке эффективности лечения больных псориазом
// Клиническая лабораторная диагностика – 2000.- № 7.- С. /
5.Ушкалова
В.Н., Кадочникова Г.Д Использование параметров,
характеризующих активность перекисного окисления липидов, при адаптации
человека к новым климатогеографическим условиям //Бюллетень экспер.
биологии и медицины.-1987.-№5.-С.571-573.
6.Львовская
Е.И., Волчегорский И.А., Шемяков
С.Е., Лифшиц Р.И. Спектрофотометрическое определение конечных продуктов ПОЛ.
//Вопросы мед. химии
.-1991.-№4.-С.92-93
7.Гончаренко
М, С., Латыпова А.М. Метод оценки ПОЛ. //
Лабораторное дело 1985 №1С. 63-69.
8.Королюк
М.А. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело 1988 №1 С.
16-19.