Создание генетической конструкции, содержащей ген бактериальной кератиназы

Authors

  • Д Миронова Республика Беларусь
  • И Казловский Республика Беларусь
  • И Бельская Республика Беларусь
  • А Зинченко Республика Беларусь

Abstract

Введение. Кератины представляют собой нерастворимые в воде фибриллярные белки, которые являются главной компонентой покровной системы человека и животных [1]. Из всех ороговевших отходов самое большое количество кератина содержат перья. Они в большом количестве образуются при обработке домашней птицы, накапливаются в окружающей среде и представляют одну из значительных угроз экосистеме вследствие их устойчивости к процессам биологического разложения. Общепринятые приемы ликвидации кератиносодержащих отходов, такие как сжигание, закапывание в грунт и гидролиз трудоемки, потребляют много энергии, не экологичны, и разрушают некоторые эссенциальные аминокислоты. Перечисленные проблемы превращают разработку биологического метода разложения кератиновых отходов в насущную задачу. [2]. По сравнению с другими методами, у микробного разложения кератина [3] есть огромные преимущества, поскольку этот экологичный метод может обеспечивать получение ряда ценных продуктов. Однако, недостатком ферментативных процессов деструкции кератина является сравнительно высокая стоимость кератиназ. Одним из возможных подходов для ее снижения в литературе рассматривается применение рекомбинантных сверхпродуцентов этих ферментов. В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось получение генетической конструкции, содержащей ген, кодирующий кератиназу, в качестве этапа создания рекомбинантного бактериального штамма, продуцирующего высокоактивную кератиназу. Методы исследования. Основой для создания генетической конструкции с геном, кодирующий кератиназу являлся вектор pET42a(+) (Novagen, США), несущий ген устойчивости к канамицину kanR, Т7-промотор, а также полилинкер с множественными сайтами клонирования. Ген кератиназы kerA был изолирован при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) из ДНК Bacillus licheniformis. Полученный ген и линейную молекулу вектора отжигали друг на друга при помощи безлигазного клонирования [4], также известного как «метод продолжительной перекрывающейся ПЦР» (ПП-ПЦР). Плазмиду из бактериальных клеток выделяли путем щелочного лизиса [5]. Рестрикционный и ПЦР-анализ, а также секвенирование полученного клона проводили по стандартным методикам [5].

References

1. Keratin: structure, mechanical properties, occurrence in biological organisms, and efforts at bioinspiration / B. Wang [et al.] // Progr. Mater. Sci. – 2016. – Vol. 76. – P. 229–318.

2. Подосокорская, О.А. Переработка отходов птицефабрик: современные подходы и перспективы / О.А. Подосокорская // Электронный научный журнал Курского государственного университета. – 2017. – № 3. – C. 1–7.

3. Lange, L. Microbial decomposition of keratin in nature – a new hypothesis of industrial relevance / L. Lange [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2016. – Vol. 100. – P. 2083–2096.

4. Quan, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways / J. Quan, J. Tian // PloS ONE. – 2009. – Vol. 4, № 7. – P. 6441–6442.

5. Green, M.R. Molecolar cloning. A laboratory manual. Fourth edition / M.R. Green, J. Sambrook // Cold Spring Harbor Lab. Press, New York. – 2012. – 630 p.

Published

2020-02-02

How to Cite

Миронова, Д., Казловский, И., Бельская, И., & Зинченко, А. (2020). Создание генетической конструкции, содержащей ген бактериальной кератиназы. Pridneprovskiy Scientific Bulletin, 6(662). Retrieved from http://www.rusnauka.com/index.php/rusnauka/article/view/1846