СОЗДАНИЕ ЭКСПРЕССИОННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ, НЕСУЩЕЙ ГЕН КСАНТОЗИНФОСФОРИЛАЗЫ Escherichia coli

Authors

  • АВ Дайнеко Республика Беларусь
  • АБ Булатовский Республика Беларусь
  • АИ Зинченко Республика Беларусь

Abstract

Введение. Биологические исследования важнейшего кофактора НАД+, присутствующего во всех живых клетках, предоставили возможность изучить патогенез процесса старения организма [1]. Истощение уровня содержания данного химического соединения в организме стало главной причиной возрастного функционального спада и появления болезней старческого возраста. Существует несколько путей синтеза кофактора НАД+, но одним из важнейших является salvage-путь, в ходе которого он продуцируется из предшественников: никотинамида, никотинамидрибозида и никотинамидмононуклеотида. Повышая уровень прекурсоров, возможно значительно восполнять уровень НАД+, утраченного в процессе старения организма [2]. Исследования зарубежных авторов показали, что никотинамидрибозид является наиболее альтернативным предшественником данного кофактора. С помощью генетических и биохимических подходов было обнаружено, что фермент ксантозинфосфорилаза в клетках Escherichia coli, известный также как пуриннуклеозидфосфорилаза-II, способен синтезировать никотинамидрибозид из никотинамида. Фермент ксантозинфосфорилаза использует никотинамид гораздо менее эффективно, чем его типичные субстраты (то есть аналоги пурина), указывая на то, что никотинамид является нетипичным субстратом. Поэтому возможность конвертировать никотинамид в никотинамидрибозид оказывается «побочным эффектом» для данного фермента. Однако такой побочный эффект является достаточным для поддержания выживаемости кишечной палочки [3]. В связи с изложенным выше, целью настоящей работы явилось: конструирование рекомбинантного вектора, несущего ген фермента ксантозинфосфорилазы в клетках E. сoli, который катализирует процесс получения никотинамидрибозида – основного промежуточного соединения важнейшего кофермента НАД+. Материалы и методы исследования. В качестве основы для создания генетической конструкции использовался вектор pET42a(+) фирмы Invitrogen (США). Данную плазмиду линеаризовали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). В представленном исследовании ген харA, состоящий из 834 пар нуклеотидов, был выделен из штамма бактерии E. coli K-12 методом ПЦР. Встраивание этого гена в линеаризованную плазмиду производили методом продолжительной перекрывающейся ПЦР (ПП-ПЦР) [4]. Полученной смесью трансформировали клетки штамма E. coli BL21(DE3) методом электропорации с помощью прибора фирмы BioRad (США). ПЦР-анализ полученных клонов-трансформантов визуализировали с помощью агарозного гель-электрофореза. Выделение плазмиды из клонов проводили c помощью коммерческого набора фирмы Jena Bioscience (Германия). Результаты исследования. Плазмида и интересующий нас ген были амплифицированы с помощью ПЦР (рис. 1) и очищены при помощи коммерческого набора PCR Purification Kit (Jena Bioscience, Германия).

References

1. Yoshino J., Baur J.A., Imai S. NAD+ intermediates: the biology and therapeutic potential of NMN and NR // Cell Metabol. – 2018. – Vol. 27, № 3. – P. 513–528.

2. Johnson S., Imai S.I. NAD+ biosynthesis, aging, and disease // F1000Res. – 2018. – Vol. 7. – Art. 132.

3. Dong W., Sun C., Zhu G., Hu S., Xiang L., Shao J. New function for Escherichia coli xanthosine phosphorylase (xapA): genetic and biochemical evidences on its participation in NAD+ salvage from nicotinamide // BMC Microbiol. – 2014. – Vol. 14, № 29. – P. 1471–2180.

4. Quan J., Tian J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways // PLoS ONE. – 2009. – Vol. 4, № 7. – Art. e6441.

5. Green M.R., Sambrook J. Molecolar cloning. A laboratory manual. Fourth edition / Cold Spring Harbor Lab. Press, New York. – 2012. – 630 p.

Published

2020-02-02

How to Cite

Дайнеко, А., Булатовский, А., & Зинченко, А. (2020). СОЗДАНИЕ ЭКСПРЕССИОННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ, НЕСУЩЕЙ ГЕН КСАНТОЗИНФОСФОРИЛАЗЫ Escherichia coli. Pridneprovskiy Scientific Bulletin, 6(662). Retrieved from http://www.rusnauka.com/index.php/rusnauka/article/view/1849